МЕТОД твердофазових АДАПТАЦІЇ КЛІТИН До важкій воді

Важка вода відрізняється від звичайної води молекулярною масою. У молекулі важкої води на відміну від звичайної води замість двох атомів водню, пов'язаних ковалентним зв'язком з атомом кисню в молекулі ці два атоми водню заміщені на дейтерій.

Атом дейтерію відрізняється від атома водню тим, що крім протона він містить нейтрон. Різниця в нуклеарною масі атомів водню і дейтерію і визначає ті гідрофобні ефекти, які важка вода чинить на клітини і організм.

Важливою проблемою для біосинтезу є адаптація клітини до важкій воді. Довгий час вважалося, що важка вода несумісна з життям. Відомо, що високі концентрації важкої води в ростовий середовищі можуть викликати інгібування життєво-важливих функцій росту і розвитку багатьох мікроорганізмів [1].

Однак, незважаючи на негативний біостатичні ефект, що надається важкою водою на клітини, деякі бактерії стійкі до високих концентрацій важкої води в середовищі [2], в той час як рослинні клітини можуть нормально розвиватися при концентраціях не більше 50-75% важкої води [3] , а клітини тварин не більше 35% важкої води [4].

Ми задалися питанням - який механізм клітинної адаптації до важкій воді і чи можуть клітини бути успішно адаптовані до зростання і біосинтезу на середовищах з максимальними концентраціями важкої води?

Для вирішення цього питання ми вибрали для експериментів бактеріальні штами-продуценти амінокислот, білків і нуклеозидів, що відносяться до різних таксономічних пологів мікроорганізмів, отриманих з Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:

1. Brevibacterium methylicum ВКПМ У 5652, лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент фенілаланіну.

2. Methylobacillus flagellatum КТ, ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент лейцину.

3. Bacillus subtilis В-3157, поліауксотрофний по гістидину, тирозину, аденіну і урацилу бацилярний штам грамнегативних бактерій, продуцент інозину.

4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пігментсодержащіе штам галофільних бактерій, здатний синтезувати бактериородопсин.

Стартовим матеріалом для культивування галофільних бактерій і бацил служила дейтерію-біомаса метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, отримана в умовах многостадийной адаптації на твердих щільних середовищах (2% агар) з 2% дейтерію-метанолом, що містять східчасто збільшується градієнт концентрації важкої води (від 0 до 98 % важкої води).

Отриману таким чином дейтерію-біомасу B. methylicum (вихід склав 100 г по вологому вазі з 1 л. Середовища) автоклавувати в 0.5 н. розчині дейтерохлорной кислоти (у важкій воді) (08 ати, 30 хв), нейтралізували 0.1 н. КОН (рН 7.0) і використовували далі в якості джерела субстрату для адаптації та культивування бацил і галофільних бактерій.

Культивуванні клітин мікроорганізмів проводили на трьох поживних середовищах (кількості компонентів наведені в г / л):

1. Мінімальна середу М9 для зростання метилотрофних бактерій, на основі різних концентрацій важкої води і добавками 0.5-2% метанолу (залежно від фізіологічної потреби бактерій) або дейтерію-метанолу: KH2PO4 3- Na2HPO4 6 NaCl 0.5- NH4Cl 1.

2. Гідролізна середу 1 (ГС1) для культивування бацил (на основі 99.9% важкої води): глюкоза 120- дейтерію-мічена біомаса B. methylicum 25- NH4NO3 30- MgSO4 x 7H2O 20- крейда 20.

3. Гідролізна середу 2 (ГС2) для культивування галофільних бактерій (на основі 99.9% важкої води): NaCl 250- MgSO4 x 7H2O 20- KCl 2- CaCl2 x 6H2O 0.065- цитрат натрію 0.5- дейтерію-мічена біомаса B. methylicum 20.

Культивування метилотрофних бактерій і бацил проводили при 370 С в колбах Ерленмейера місткістю 250 мл з наповненням середовищем до 50 мл в умовах аерації за методиками [5-8], використовуючи в якості джерел дейтерію важку воду і дейтерію-метанол. Культивування галофільних бактерій проводили на тяжеловодородной середовищі при висвітленні лампами денного світла ЛБ-40.

Для проведення адаптації був обраний ступінчастий режим збільшення концентрації важкої води в ростових середовищах у присутності 0.5-1% -ного метанолу / дейтерію-метанолу, так як ми припустили, що поступове звикання організму до дейтерію буде надавати сприятливий ефект на параметри росту і загальне самопочуття клітин.

Запропонований нами метод твердофазної адаптації складається з серії множинних адаптаційних пасажів вихідної культури на чашках Петрі з твердими агаризованими середовищами зі ступінчастому збільшенні концентрації важкої води в них (від 0 до 98% важкої води).

При цьому на чашках Петрі послідовно відбиралися окремі колонії, що виросли на середовищах, що містять низькі концентрації важкої води. Потім їх послідовно пересівали на тверді середовища з більшим ступенем дейтерірованності, включаючи середу з 98% важкою водою (ступінь виживання бактерій на максимальній тяжёловодородной середовищі склала не більше 50%).

Таким чином на чашках Петрі з максимальною концентрацією важкою водою були виділені окремі клітинні клони, кожні з яких представляли собою потомство отдой єдиної клітини, стійкої до дії важкої води.

За ходом адаптації клітин спостерігали за змінами тривалості лаг-фази, часу клітинної генерації і виходів мікробної біомаси, а також по максимальному рівню накопичення кінцевих продуктів біосинтезу в культуральної рідини. Ріст бактерій оцінювали за здатністю до утворення окремих колоній на поверхні твердих щільних середовищ, а також за величиною оптичної щільності суспензії клітин, виміряної на спектрофотометрі Beckman-DU6 (США) при 540 нм.

Перші досліди з адаптації клітин до важкій воді привели до невдачі. Штам M. flagellatum виявив підвищену чутливість до важкій воді: інгібування швидкості росту бактерій спостерігалося при концентрації важкої води в середовищі 74.5%, в той час як дейтерій-метанол не чинив істотного впливу на швидкість росту клітин. Так, на середовищі, що містить 74.5% важку воду вихід мікробної біомаси склав 29%, що в 3.4 рази нижче, ніж в контрольних експериментах, коли використовували звичайну воду і метанол, в той час як вихід мікробної біомаси на водному середовищі з 1% -ним дейтерій-метанолом був знижений всього лише в 1.2 рази.

Спроби адаптувати інший штам B. methylicum до зростання на важкій воді при збереженні здатності до біосинтезу фенілаланіну привели до позитивного результату. При зростанні клітин B. methylicum на звичайній воді тривалість лаг-фази не перевищувала 20 год, в той час як зі збільшенням концентрації важкої води в ростових середовищах до 98% тривалість лаг-фази збільшувалася до 60 годин.

Ми виявили, що тривалість часу клітинної генерації зі збільшенням концентрації важкої води в ростових середовищах поступово збільшується, досягаючи 4,9 годин на середовищі з 98% важкої води і 2% дейтерію-метанолом. На відміну від важкої води, дейтерію-метанол не викликав інгібування росту і не впливав на виході мікробної біомаси. Навпаки, на максимально концентрованої важкій воді водою вихід мікробної біомаси був знижений в 3.3 рази в порівнянні з контролем.

Важливо те, що вихід мікробної біомаси та рівень накопичення фенілаланіну в культуральній рідині при зростанні адаптованого до важкій воді мікроорганізму в максимально концентрованої важкій воді змінюються порівняно з контрольними умовами на 13 і 5%, т. Е. Незначно.

У наступних дослідах була досліджена здатність до зростання на важкій воді бацилярних штаму B. subtilis, продуцента інозину. Зростання даного штаму найкраще відбувався на ГС 1 середовищі, що містить як джерело вуглецю глюкозу, а в якості джерела ростових факторів гідролізати дейтерій-міченої біомаси метилотрофних бактерій B. methylicum.

Даний штам вдалося адаптувати до важкій воді шляхом розсіву на тверду щільних середовищах ГС 1 з 99.9% важкої води. Він відразу виявив нормальний ріст на важкій воді.

При культивуванні адаптованого B. subtilis на рідкої ГС 1 середовищі, рівень накопичення інозину в культуральній рідині знижується по-порівнянні з вихідним штамом.

При зростанні вихідного штаму B. subtilis на середовищі, що містить звичайну воду і протоновану біомасу рівень накопичення інозину в культуральній рідині досягав величини 17 г / л після п'яти діб культивування. Разом з тим рівень накопичення інозину на ГС 1 середовищі, був знижений в 4.4 рази в порівнянні з вихідним штамом на протоновану середовищі.

Знижений рівень продукції інозину на в цих умовах корелює зі ступенем конверсії глюкози, яка на важкій воді асимілювалася не повністю, про що свідчили значні кількості накопиченої в культуральної рідини глюкози після ферментації.

У випадку з галофільних бактерією H. halobium адаптацію проводили як на агарі, що містить 99.9% важку воду з додаванням гідролізату дейтерію-міченої біомаси B. methylicum, шляхом розсіву штаму до окремих колоній, так і на рідкому ГС 2 середовищі. У звичайних для цієї культури умовах культивування (37 0С, на світлі) в клітинах синтезувався фіолетовий пігмент за всіма характеристиками не відрізняється від нативного мембранного білка бактериородопсина.

Проведені нами дослідження свідчать, що здатність до адаптації до важкій воді в різних родів і видів бактерій різна і може варіювати на прикладі метилотрофних бактерій в межах навіть однієї таксономічної групи. З цього можна зробити висновок, що адаптація до важкій воді визначається як таксономической специфічністю мікрооорганізмов, так і особливостями їх метаболізму, функціонуванням різних шляхів асиміляції субстратів, а також еволюційної нісшіх, яку займає досліджуваний об'єкт.

При цьому чим нижче рівень еволюційного розвитку організму, тим краще він пристосовується до присутності дейтерію в середовищі. Так, з вивчених об'єктів самими примітивними в еволюційному плані є галофільні бактерії, що відносяться до археобактерій, практично не потребує адаптації до важкій воді, чого не можна сказати про метилотрофних бактеріях, які важче адаптуються до важкій воді. Для всіх вивчених мікроорганізмів зростання на важкій воді супроводжувався зниженням ростових характеристик а також рівня продукції секретується БАС.

Отримані для вивчених мікроорганізмів дані в цілому підтверджують стійке уявлення про те, що адаптація до важкій воді є фенотипическим явищем, оскільки адаптовані до важкій воді клітини повертаються до нормального зростання і біосинтезу в протоновані середовищах після деякого лаг-періоду.

Мабуть, метаболізм адаптованих кліток не зазнає істотних змін у важкій воді. У той же час ефект оборотності зростання на водно / тяжёловодородних середовищах теоретично не виключає можливості того, що ця ознака стабільно зберігається при зростанні у воді, але маскується при перенесенні клітин на важку воду. Однак, тут необхідно підкреслити, що для проведення адаптації відіграє важливу роль складу середовища культивування.

При цьому не виключено, що при проведенні адаптації на мінімальних середовищах, що містять важку воду утворюються форми бактерій, ауксотрофності за певними ростовим факторів, наприклад амінокислотам, і внаслідок цього бактеріальний ріст інгібується. Адаптація до важкій воді відбувається найкраще саме на комплексних середовищах, що містять широкий набір ростових факторів і амінокислот, компенсуючих потреба бактерій в цих сполуках.

Можна припустити, що клітина реалізує лабільні адаптивні механізми, які сприяють функціональної реорганізації роботи життєво-важливих систем у важкій воді. Так, наприклад, нормальному биосинтезу і функціонуванню в важкій воді таких біологічно активних сполук, як нуклеїнові кислоти і білки сприяє підтримання їх структури за допомогою формування водневих (дейтерієвої) зв'язків в молекулах.

Зв'язку, сформовані атомами дейтерію розрізняються по міцності та енергії від аналогічних водневих зв'язків. Відмінності в нуклеарною масі атома водню і дейтерію побічно можуть служити причиною відмінностей у синтезах нуклеїнових кислот, які можуть призводити в свою чергу до структурних відмінностей і, отже, до функціональних змін в клітці. Найімовірніше, що ферментативні функції і структура синтезованих білків також змінюються при зростанні клітин на важкій воді, що може відбитися на процесах метаболізму і ділення клітини.

Деякі дослідники повідомляють, що після зворотного ізотопного (1Н-2H) -обміну ферменти не припиняють своєї функції, але зміни в результаті ізотопного заміщення за рахунок первинного та вторинного ізотопних ефектів, а також дія важкої води як розчинника (велика структурованість і в'язкість в порівнянні з звичайною водою) приводили до зміни швидкостей і специфічності ферментативних реакцій у важкій воді.

Структурно-динамічні властивості клітинної мембрани, які в більшості залежать від якісного і кількісного складу ліпідів, також можуть змінюватися в присутності важкої води. Отриманий результат пояснюється тим, що клітинна мембрана є однією з перших органел клітини, яка відчуває вплив важкої води, і тим самим компенсує реалогічних параметри мембрани (в'язкість, текучість, структурованість) зміною кількісного складу ліпідів.

У загальних рисах, при попаданні клітини в дейтерированного середу з неї не тільки зникає протонированная вода за рахунок реакції обміну вода-важка вода, але й відбувається дуже швидкий ізотопний (1Н-2H) -обмін в гідроксильних, карбоксильних, сульфгідрильних і аминогруппах всіх органічних сполук , включаючи нуклеїнові кислоти, ліпіди, білки і цукру.

Відомо, що в цих умовах тільки С-Н зв'язок не піддається ізотопного обміну і внаслідок цього тільки з'єднання зі зв'язками типу С-D можуть синтезуватися de novo.

Крім вищеозначених ефектів, можлива зміна співвідношення основних метаболітів в процесі адаптації до важкій воді також може негативно позначатися на ріст клітини. Ми припустили, що ефекти, які спостерігаються при адаптації до важкій воді пов'язані з утворенням у важкій воді конформаций молекул з іншими структурно-динамічними властивостями, ніж конформаций, утворених за участю водню, і тому мають іншу активність і біологічні властивості.

Так, за теорією абсолютних швидкостей розрив СH-зв'язків може відбуватися швидше, ніж СD-зв'язків, рухливість іона D + менше, ніж рухливість Н +, константа іонізації важкої води дещо менше константи іонізації звичайної води.

Підсумовуючи отримані дані, ми зробили висновок, що чутливості різних клітинних систем до важкій воді відмінні. З точки зору фізіології, найбільш чутливими до заміни Н + на D + можуть виявитися апарат біосинтезу макромолекул і дихальна ланцюг, т. Е., Саме ті клітинні системи, які використовують високу рухливість протонів і високу швидкість розриву водневих зв'язків.

Нам видається вибір бактерій як модельних об'єктів для даних досліджень найбільш доцільним, оскільки прокаріоти як організми, що стоять на нижчих щаблях розвитку живого, найбільш лабільні в генетичному аспекті і тим самим швидше реагують і пристосовуються до мінливих факторів середовища.

к.х.н. О.В. Мосін

Список літератури:

1. Crespi HL Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd. // Ed. R. R. Muccino. - Elsevier. - Amsterdam, 1986 - P. 111-112.

2. Katz J, Crespi H.L. // Pure Appl. Chem. - 1972. - V.32. - P. 221-250.

3. Daboll HF, Crespi HL, Katz JJ // Biotechnology and Bioengineering. - 1962. - V. 4. - P. 281-297.

4. Crespy HL Stable Isotopes in the Life Sciences. - International atomic energy agency. - Vienna. - 1977. - P. 111-121.

5. Мосін О. В., Карнаухова Є. М., Пшеничникова А. Б., складна Д. А., Акімова О. Л. // Біотехнологія. - 1993. - N 9. - С. 16-20.

6. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Юркевич А. М., Швець В. І. // Біотехнологія. - 1996. - N 3. - С. 3-12.

7. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Швець В. І. // Біоорганічна хімія. - 1996. - Т. 22. - N 10-11. - С. 856-869.

8. складаний Д. А., Мосін О. В., Єгорова Т. А., Єрьомін С. В., Швець В. І. // Біотехнологія. - 1996. - N 5. - С. 25-34.